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獻給學者:瞬時轉染DNA的實驗方法

發布時間:2018-07-13 15:11 信息來源: 閱讀次數:

一般情況下,瞬時轉染是將 DNA 導入真核細胞的方式之一。在瞬時轉染中,重組 DNA 導入感染性強的細胞系以獲得目的基因暫時但高水平的表達。


轉染的 DNA 不必整合到宿主染色體,可在比穩定轉染較短時間內(最多一周左右)收獲轉染的細胞,并對溶解產物中目的基因的表達進行檢測。


如果過表達基因用質粒,如果敲降用的是 siRNA(在 microRNA 實驗中,過表達用的是 mimics,敲降用的是 inhibitor)。


通過瞬時轉染,將目的基因敲降或者過表達(gain and loss 實驗),觀察下游靶基因的表達情況,或者細胞表型(phenotype)的變化,例如凋亡,周期,增殖,侵襲,轉移等。那該怎么做呢



01

實驗前準備



lipofectamine2000(轉染試劑)(避光),Opti-MEMI減血清培養基(避光),目的基因的質?;蛘遱iRNA(以siRNA為例),細胞,六孔板,培養基,以及一些細胞實驗所需的普通物品。


02

步驟



1)細胞接種:轉染實驗前天接種細胞,各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞密度應達到60%~80%覆蓋。


2)細胞轉染:1.一般六孔板液體每孔在 2ml 左右,不宜太多,或者太少。取兩個 1.5mlEP 管,記為 A 管,B 管,每個 EP 管加入 250ul Opti-MEM I,然后 A 管加入 5-10ul lipofectamine 2000,B 管加入 100pM-200pM 的 siRNA(見買來的 siRNA 說明書),然后靜置 5min,混合在一起,靜置 20min,用 AB 混合液加入到 1.5ml 的無血清培養基 C 內,混勻;


2. 將六孔板里的細胞的液體吸出,用 PBS 清洗兩遍;


3. 將 ABC 混合液 2ml 加入六孔板中;


4.4-6h 后換成正常血清培養基(忌放抗生素),在培養箱內培養;


5.48h 后提取 RNA 或者 72h 提取蛋白,或者 48h 后進行后續相關實驗。



03

實驗流程圖



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