支原體能夠在特定的固體瓊脂培養(yǎng)基上形成經(jīng)典的“油煎荷包蛋”式的菌落，因此可以在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)支原體，通過(guò)觀察菌落形態(tài)以判斷是否存在支原體污染。這是最直觀的方法，也是最早的方法，但人們后來(lái)發(fā)現(xiàn)有很多支原體難以在固體培養(yǎng)基上形成菌落，因此，該法容易造成假陰性結(jié)果。

支原體在液體培養(yǎng)基中也能夠較好地生長(zhǎng)，在支原體數(shù)目增長(zhǎng)到一定程度之后，培養(yǎng)基中的PH值會(huì)發(fā)生顯著變化，如果在培養(yǎng)基中添加指示劑，這種變化會(huì)非常直觀地顯現(xiàn)出來(lái)。

單純的液體培養(yǎng)基檢測(cè)經(jīng)常受到指示劑加入量、變色范圍較小等因素的干擾。因此液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法通常一起使用，使檢測(cè)結(jié)果更加可靠。培養(yǎng)法的檢測(cè)時(shí)間在28天左右，時(shí)間較長(zhǎng)。

大多數(shù)支原體的DNA中AT堿基的含量較高（55%~80%），DNA熒光染料Hoechst 33258或DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以結(jié)合到AT含量較高的DNA鏈上。所以在使用熒光染料染色后，被支原體污染的指示細(xì)胞除了細(xì)胞核發(fā)出熒光外，細(xì)胞表面、周?chē)囵B(yǎng)基和培養(yǎng)皿中也含有熒光小點(diǎn)。

為防止檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)細(xì)胞破裂后散出DNA等不確定因素造成假陽(yáng)性或不清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通常會(huì)使用待檢測(cè)樣品的培養(yǎng)液，去感染易使支原體增殖的指示細(xì)胞（無(wú)污染的Vero細(xì)胞或經(jīng)藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞），故又稱(chēng)指示細(xì)胞法。

對(duì)于細(xì)胞粘附性比較差的支原體（精氨酸類(lèi)支原體），染色法的檢出效果較差，所以在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中通常將染色法和培養(yǎng)法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行結(jié)果判定。

注：對(duì)可能引起指示細(xì)胞病變的且缺少有效中和抗體的高滴度病毒樣本來(lái)說(shuō)，不能使用DNA染色法進(jìn)行檢測(cè)。

相較于其他PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可以通過(guò)觀察熒光擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增情況來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)支原體的污染情況，具有較好的特異性和準(zhǔn)確性。并且不需要在PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行凝膠電泳，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

雖然支原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)法彌補(bǔ)了培養(yǎng)法和DNA染色法耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，也在一定程度上增加了檢測(cè)的靈敏度，但因其陽(yáng)性檢出率往往受到引物所能擴(kuò)增的支原體種類(lèi)的制約，且容易受到樣品核酸提取方法、與支原體親緣關(guān)系較近的基因干擾等外源因素的影響。所以驗(yàn)證每種支原體核酸檢測(cè)方法的檢測(cè)限(Detection Limit)、特異性(Specificity)、耐用性(Robustness)是非常必要的。